发布日期：2018-03-30
继“大师兄”被克隆以来，能精准模拟人类疾病的“二师兄”也成功地被克隆出来
导语：
在广州九龙镇有一座“猪宾馆”，生活着一群身娇肉贵的实验小猪，它们能精准地模拟人类的疾病。这是因为科学家利用基因“剪刀”—— CRISPR/Cas9，精准地把人突变的亨廷顿基因HTT敲入到猪的亨廷顿基因中，从而使猪得了亨廷顿舞蹈病。这些经过改造的猪可应用于人类试药、干细胞的临床前评价等领域，最终将造福人类健康。这项研究也是继今年1月以来，中国科学院神经科学研究所一组学者在克隆猴领域取得的重大突破以来，该领域又一重要的发现。
经过四年努力，由暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江教授、中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学研究员以及美国Emory大学李世华教授领衔的国际研究团队，首次利用基因编辑技术CRISPR/Cas9和体细胞核移植技术（SCNT），成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈病基因敲入猪，精准地模拟出人类神经退行性疾病。
这项研究的三位通讯作者，李世华（前排左）李晓江（前排中）和赖良学（前排右）。
亨廷顿舞蹈症猪模型的构建，研究的共同第一作者分别为闫森副研究员、涂着池博士和刘朝明。
HD 基因敲入猪制备流程图
这项研究为开发治疗亨廷顿舞蹈症，提供了稳定、可靠的动物模型，也为培育其它神经退行性疾病大动物模型提供了技术和理论依据，将推动我国发展出大动物疾病模型的医药研发产业链，相关研究于北京时间3月30日在线发表在国际顶尖学术期刊《细胞》杂志上。
李晓江对《知识分子》表示，“我们把这个动物模型建起来之后，也可以建立其他的疾病动物模型，如阿尔兹海默症、帕金森病等疾病的猪模型，它们要比小鼠的疾病模型会更好。因此从动物模型的构建来说，这有重要的意义；第二点，我们可以用这个模型来筛选药物治疗的方法，如小鼠动物模型由于缺乏神经元死亡重要的病理特征，用药评价一般都是基于行为学观察，而猪是非常好的模式动物来评价药物的效果。”
李晓江是美国Emory大学人类遗传系教授，在神经退行性疾病领域做出许多重要成果，2010年入选为中组部“千人计划”，2017年成为暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院教授。该研究院以暨南大学-香港大学脑功能与健康联合实验室为基础，2012年正式成立。
亨廷顿舞蹈症是单基因突变导致的疾病
亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等，是当今社会严重威胁人类健康的神经退行性疾病。这些疾病伴随年龄渐长而产生、可遗传、呈渐进性发展，由于缺乏合适的动物模型进行药物筛选，目前尚无有效的治疗方法。
李晓江说，神经退行性疾病是致病蛋白变异后沉淀在神经细胞中，造成神经细胞功能紊乱，并引发神经细胞死亡，从而导致疾病发生。而亨廷顿舞蹈病是由单基因（HTT）突变导致的神经退性疾病，是一个理想的疾病模式，可用于研究蛋白质错误折叠如何引起选择性的神经退性病变，为以后多基因突变病症研究提供基础。
“夫妻档”科学家与猴做朋友
小鼠作为最常见的动物模型，已被广泛地用于研究人类疾病机理和寻找临床治疗方法。李晓江团队在研究中发现，表达突变基因的神经退行性疾病小鼠模型，并不能表现出像病人脑中一样的典型神经细胞死亡的重要病理特征。许多有治疗效果的药物在小鼠模型中有效，在临床上对病人往往无效。为了探索动物模型，他开始把目光转移到大动物、非人灵长类动物身上。
早在2008年，“夫妻档”科学家李晓江、李世华在美国Emory大学合作者的支持下，通过将外源性的突变基因引入到猕猴的体内，成功地建立了世界首只转基因亨廷顿病猴模型。李晓江说，在该模型中，可以明显地观察到相应的病理特征和行为变化，但表达外源性致病基因片段的毒性过强。实验中的转基因猴子基本上在出生后较短时间内死亡，同时无法传代。因此转基因亨廷顿疾模型无法达到筛选治疗疾病的药物的目的。
为何“二师兄”成为科学家的掌中宝？
亨廷顿舞蹈症模型猪得到科研人员的严密呵护
位于广州九龙镇的“猪宾馆”，科学家正精心饲养着一群身价不菲的实验小猪。与果蝇、线虫、小鼠等小动物相比，猪被公认为是人类医学研究理想的大动物模型。
赖良学解释道，猪的心血管系统、消化系统、皮肤、营养需要、骨骼发育以及矿物质代谢等都与人的情况极其相似，猪的体型大小和驯服习性允许科研人员进行反复采样和各种外科手术。
他还提到，与非人灵长类动物相比，猪的基因多样、繁殖周期短、一窝产仔多，便于根据特殊需要进行选育，也不存在伦理学方面的问题。所以猪的疾病模型用于做药物筛选、人类疾病研究、干细胞治疗的研究结果，更容易转化为临床应用。作为华南地区重要的大动物疾病模型实验平台之一，赖良学团队先后建立了50余种在生物医药和农业领域具有重要价值的转基因和基因打靶克隆猪。
2010年，这对“夫妻档”找到了赖良学，他们一拍即合，合作建立了首例转基因亨廷顿病猪模型。与猴模型一样，猪模型也具有明显的表型特征，但不易存活、无法传代。这一问题让他们感到非常困惑，“人是在某个定点的基因突变而导致亨廷顿疾病，而目前转基因技术是随机地在体内基因组中插入外源性突变基因，其表达量也高于内源性致病因。”
大胆的设想：“基因魔剪”和克隆技术帮大忙
研究人员进而分析发现，亨廷顿舞蹈病是内源性基因突变而造成的，如果直接把猪的内源性基因改变为突变基因，猪的病理变化应该与病人的病理状态更接近。然而，基因敲入的效率太低，在大动物中很难获得。2013年，随着基因编辑技术CRISPR/Cas9被广泛应用于哺乳动物中，在广东省科技计划的支持下，他们大胆尝试这一科学设想，李世华着手应用Cas9技术建立亨廷顿基因敲入猪模型。
通过团队通力的合作，他们利用CRISPR/Cas9技术，将人突变的亨廷顿基因插入到猪的内源性亨廷顿基因的表达框中，即人外显子1中包含150 CAG重复序列，精确地插入到猪的HTT内源性基因中。
但最终能否成功，还要看实验的进展。研究者利用成纤维细胞筛选出阳性克隆细胞，事实上，这也并非易事。“单细胞逐个挑出来并进行筛选及鉴定，一定要挑选状态最好的细胞用来胚胎移植”。负责此项实验工作的闫森先后筛选了上千个细胞，从中挑出确定带有突变基因且状态最好的细胞，她说，“每天早上7点进入细胞间，看细胞、换液、不停地跟细胞打交道，一抬头已是下午3点。好不容易筛选到的阳性克隆细胞如果状态不好又得重来，只有大量筛选才能获得最优的细胞克隆。”
“这的确是一个很大的工作量。”李晓江表示。除此之外，还遇到其他的困难，“当我们的F0代猪出生时，尽管数量比较多，但一开始没经验，由于群养争斗、抢食等因素，造成亨廷顿舞蹈症的模型猪死了不少，幸好还有两只存活下来，然后我们让它们交配，产生F1代的猪，之后再产生F2的猪。第三个难点是，模型猪传代也比较困难，只有稳定遗传特定表型的猪，才是我们想要的。”
正常的和患有亨廷顿症的猪模型行为比较
幸运的是，这项实验顺利地进入到下一步，他们运用体细胞核移植技术进行克隆，成功培育出带有突变基因的新生猪。在历经5个月的观察后，亨廷顿猪出现了运动障碍等渐进性发病的表型。再进一步就是将稳定表达的基因敲入亨廷顿猪繁殖下去。由于疾病模型猪身体状态不好，在传代过程中更需要悉心的照料。在团队的呵护下，最终这些亨廷顿舞蹈症模型猪生产出小猪。
为了证明亨廷顿基因敲入猪的病理特征更接近于人类。李世华多次从美国返回国内指导实验，到猪场看小猪的生存环境及生活状态。至于模型猪能否很好地评估人类的亨廷顿舞蹈症，它与人的疾病症状有多相近？
李晓江就此对《知识分子》表示，“总体来说，还只能说是相近，两个物种毕竟还是有种属差别。但在很多方面，如猪的神经细胞死亡病理方面跟人非常相近，而小鼠没有明显的神经细胞死亡特征。另外，小鼠的‘舞蹈’行为很难体现出来，猪的这些行为跟人非常相似。此外，我们也发现，这些模型猪很多是因为呼吸衰竭而死亡，跟亨廷顿舞蹈症病人一样，它们也因运动神经的死亡，容易引起肺炎，进而死亡，所以从猪的这些病理表型和行为，跟人更为接近。
小心求证：亨廷顿舞蹈症猪模型构建成功
亨廷顿基因敲入猪纹状体中明显的神经元死亡
纹状体出现明显的萎缩
实验结果传来，他们成功了。该模型不但能够模拟亨廷顿症患者大脑纹状体的神经元选择性死亡的典型病理特征，在行为上也表现出类似亨廷顿症”舞蹈样“的异常行为。
更难能可贵的是，这些病理及行为学表型都可稳定地遗传给后代。作为世界首例亨廷顿病猪基因敲入模型，它表明在模拟病人的神经病理变化特别是脑疾病方面，大动物模型比小动物模型更具优势。
可为人类试药，造福于人类
神经疾病基因敲入猪的成功，将推动我国发展出大动物疾病模型的医药研发产业链，促进针对阿尔茨海默病、帕金森症等神经退行性疾病，以及免疫缺陷、肿瘤、代谢性疾病的新药研发进程。同时，该动物模型可用于干细胞治疗等手段的临床前评价，最终造福于人类。
从事多年研究亨廷顿病的资深专家、美国加州大学洛杉矶分校杨向东（X. William Yang）教授指出，亨廷顿舞蹈症基因敲入猪的建立是神经退行性疾病研究领域中一个里程碑式的发现，使科学家能更深入了解神经细胞死亡的机制及寻找有效的治疗方法。
非人灵长类动物模型是否会比猪模型会更好呢？今年1月25日，中科院神经科学研究所孙强等研究人员率先利用体细胞克隆出猴，备受外界关注，其中有一点是，未来这些克隆猴也会用来构建疾病模型。未来需不需要构建亨廷顿舞蹈症猴模型？李晓江表示，”目前亨廷顿舞蹈症猴模型还没有，主要是由于基因敲入猴胚胎的效率太低。“但他同时表示，构建这一疾病的猴模型仍十分有意义，因为它在行为特征表现上会比猪模型会更好，由此能更好地寻找有效的治疗策略。
来源：知识分子（微信号 The-Intellectual）
